Holbrook și-a făcut debutul în film în The Group (1966) al lui Sidney Lumet. Ulterior, a câștigat faimă internațională pentru interpretarea sa ca Deep Throat în filmul din 1976 All the President's Men. A jucat rolul lui Abraham Lincoln în miniseria din 1976 Lincoln și în miniseria din 1985 North and South. De asemenea, a apărut în filme precum Julia (1977), The Fog (1980), Creepshow (1982), Wall Street (1987), The Firm (1993), Hercules (1997) și Men of Honor (2000).
Rolul lui Holbrook ca Ron Franz în Into the Wild (2007) al lui Sean Penn i-a adus atât nominalizări la premiul Oscar, cât și la premiul Screen Actors Guild pentru Cel mai bun actor în rol secundar. În 2009, Holbrook a primit recunoaștere critică pentru interpretarea sa ca fermierul recent pensionat Abner Meecham în filmul independent That Evening Sun. De asemenea, l-a interpretat pe Francis Preston Blair în Lincoln (2012) al lui Steven Spielberg.
În 2003, Holbrook a fost onorat cu Medalia Națională pentru Umanități de către președintele George W. Bush.